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08月01 轉(zhuǎn)錄調(diào)控研究中公共數(shù)據(jù)整合分析思路
分析思路1
? ? ? ?共表達分析中，整合大量相關(guān)公共樣本測序數(shù)據(jù)，可構(gòu)建出相較于常規(guī)樣本量下可靠度更高的基因共表達網(wǎng)絡(luò)，從而基于該網(wǎng)絡(luò)進行更加準確的后續(xù)分析：a）預(yù)測目標轉(zhuǎn)錄因子的下游調(diào)控基因、目標調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子；b）預(yù)測ncRNA與mRNA之間的靶向關(guān)系；c）基于網(wǎng)絡(luò)中已知功能基因推測同網(wǎng)絡(luò)中其他功能未知基因功能；e)?將每個共表達模塊分別作為一個整體，計算其與各組織或各發(fā)育時間點之間的相關(guān)性，建立各組織相關(guān)或各時期相關(guān)基因表達網(wǎng)絡(luò)……
思路解析：
一般認為，在功能上具有相關(guān)性的基因在生物體內(nèi)具有相似的表達模式，比如轉(zhuǎn)錄因子與其下游調(diào)控基因、lncRNA與其反式調(diào)控的靶基因、處于同一代謝通路的基因等在功能上都具有相關(guān)性，因此，研究者可根據(jù)每個基因的表達模式，來判斷上述幾種相互關(guān)系。
生信分析中，研究者可使用共表達分析的方法，基于轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)，分析每個基因的表達模式，最終將不同的基因劃入各自所在的表達模式網(wǎng)絡(luò)中，常用的共表達分析方法主要有兩種WGCNA與k-means，大樣本量下（15組以上的樣本）建議使用WGCNA，該算法相較于K-means，采用對相關(guān)系數(shù)取冪加權(quán)處理、考慮兩個基因間的間接相關(guān)等優(yōu)化算法，使得構(gòu)建的共表達網(wǎng)絡(luò)更加符合基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的無尺度網(wǎng)絡(luò)分布（scale-free networks）、基因間可間接調(diào)控等特征。
無論是使用哪種方法進行共表達分析，從統(tǒng)計學的角度來看，樣本量越大，預(yù)測的基因表達模式分辨率更高，構(gòu)建的共表達網(wǎng)絡(luò)也就越可靠。受限于項目經(jīng)費，很多研究者便借助公共數(shù)據(jù)庫擴充這類共表達分析中的樣本量。
支持文獻思路概述：
a) Jennnifer等人鑒定了Specialized Metabiolic（后面簡稱SM）代謝通路相關(guān)基因，此類基因種類較少，且序列保守性較低，難以通過常規(guī)的序列同源比對的方法預(yù)測，因此研究者采用了基于基因表達量的共表達分析方法，參考少數(shù)已知功能基因，鑒定存在于不同植物中的SM代謝相關(guān)基因以及SM代謝網(wǎng)絡(luò)。研究者搜集了8個植物物種的10個基因共表達數(shù)據(jù)集合的21,876個實驗的基因芯片和RNA-seq公共數(shù)據(jù)，構(gòu)建了各個物種中高可靠度的基因共表達模塊。為了說明本研究鑒定SM途徑方法的可靠性，篩選了甲硫氨酸來源的脂肪族硫代葡萄糖苷生物合成途徑（metGSL）及基因，與鑒定的共表達基因模塊進行比較分析。在擬南芥中，共表達基因模塊鑒定了metGSL生物合成每一步的基因，以及一個特異的轉(zhuǎn)運子和3個轉(zhuǎn)錄因子。比如，在最小的N1（共17個基因）網(wǎng)絡(luò)中，metGSL途徑的34個酶基因中14個均在這個模塊中，該模塊中只有3個基因是功能上未鑒定屬于metGCL的。在網(wǎng)絡(luò)中，還發(fā)現(xiàn)參與metGSL相關(guān)生化過程的一些基因，如激酶APK1和APK2、細胞色素P450基因CYP79B2和CYP79B3。因此，利用該研究中建立的共表達網(wǎng)絡(luò)可較為準確預(yù)測SM代謝通路相關(guān)基因，該成果發(fā)表于The Plant Cell雜志【文獻詳細解讀見附件1】。
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共表達基因模塊重現(xiàn)擬南芥metGSL生物合成途
b)Yu C等人，為了揭示與玉米子葉發(fā)育各個時期相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子-調(diào)控基因（之后簡稱TF-TFBS）調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，利用公共數(shù)據(jù)，將樣本量從9組個擴充至22組，進行WGCNA分析，建立了與玉米子葉發(fā)育各個時期相關(guān)共表達模塊?；诠脖磉_信息，并參考基因GO注釋、TF-TFBS數(shù)據(jù)庫（TRANSFAC、JASPAR、AthaMap等），總共得到176個TF-TFBS，成果發(fā)表于PNAS雜志?！?strong>原文題目見附件2】
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TF-TFBS預(yù)測過程
c)Wen Z等人，為了鑒定與大鼠各個發(fā)育時期各個組織相關(guān)的ncRNA及其與mRNA共同參與的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，從GEO數(shù)據(jù)庫中下載得到Y(jié)ing等人上傳的原始轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)（GSE53960），數(shù)據(jù)集中包含來自四個發(fā)育時間點的32只大鼠的320個bodymap樣本的轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)。首先基于測序數(shù)據(jù)進行轉(zhuǎn)錄本組裝、定量、ncRNA鑒定、差異表達等前期分析，然后基于基因定量結(jié)果，使用方差分析（analysis variance，ANVOA）鑒定不同的發(fā)育時期、不同的組織部位中或性別間顯著差異的基因（Benjamin-Hochberg corrected p-value < 0.05），鑒定獲得的差異基因即為時期相關(guān)、組織相關(guān)或性別發(fā)育相關(guān)基因，之后利用WGCNA分別對上述各個基因集構(gòu)建共表達網(wǎng)路模塊，最終鑒定得到32個器官發(fā)育相關(guān)模塊、4個性別發(fā)育相關(guān)模塊、14個發(fā)育時期相關(guān)模塊。該成果發(fā)表于Scientific Reports雜志【文獻詳細解讀見附件1】。
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發(fā)育時期相關(guān)共表達模塊
d)LiJ等人為了全面鑒定豬的長鏈非編碼RNA（lincRNAs）和探索lincRNAs在豬植入前胚胎發(fā)育（PED）過程中可能發(fā)揮的作用，從NCBI-SRA數(shù)據(jù)庫中下載得到五個豬RNA-Seq數(shù)據(jù)集?；跍y序數(shù)據(jù)進行轉(zhuǎn)錄本組裝和篩選后獲得了7,618個lincRNAs。在分析了豬lincRNAs的結(jié)構(gòu)特點、表達模式、組織特異性和順式作用后，對胚胎發(fā)育階段相關(guān)lincRNAs和mRNAs進行了WGCNA分析，鑒定出了23個共表達模塊，其中5個顯示發(fā)育階段特異性。qRT-PCR分析4細胞階段特異性模塊中的樞紐基因集后發(fā)現(xiàn)了兩個與PED密切相關(guān)的lincRNA：TCONS_00166370 和TCONS_00020255。該成果發(fā)表于Scientific Reports雜志【文獻詳細解讀見附件1】。
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共表達網(wǎng)絡(luò)分析PED相關(guān)lincRNAs
分析思路2
????研究某一類基因的轉(zhuǎn)錄水平在不同處理下（或不同組織部位間、或不同發(fā)育時間點等）的變化規(guī)律，可整合多個類似研究中的公共測序數(shù)據(jù)來共同揭示該變化規(guī)律，使結(jié)果更加可靠。
思路解析：
該思路相對比較簡單，但是若論點新穎，多個項目或多個物種的數(shù)據(jù)均對此論點支持，該分析也可單獨成文；該分析也可作為對常規(guī)轉(zhuǎn)錄調(diào)控分析的補充，從常規(guī)分析得到的一些相關(guān)基因中挑選一些關(guān)鍵基因，在其他物種、其他類似項目中尋找對該類關(guān)鍵基因在該項目中某種變化規(guī)律的支持證據(jù)，可以提升常規(guī)分析的廣度。
支持文獻思路概述：
?a）sweet基因家族編碼一類外排轉(zhuǎn)運蛋白（efflux transporter），與糖運輸、韌皮部裝載、宿主-病原菌互作、生殖組織發(fā)育相關(guān)，這類基因的研究主要集中在水稻與擬南芥中，而在大豆中的研究幾乎是空白。
Gunvant P等人搜集了公共數(shù)據(jù)庫中兩個大豆RNA-seq數(shù)據(jù)集，分別包含14、10個樣本，均涵蓋生殖組織（花、花芽、種子等）與營養(yǎng)組織（根、莖、幼苗等）。研究者首先基于水稻、擬南芥的sweet家族基因序列，通過blast比對，在大豆的基因組中鑒定得到52個大豆sweet家族基因，并對該類基因在染色體上的分布和編碼蛋白的domain結(jié)構(gòu)與其他13個物種（涵蓋單子葉、雙子葉、藻類、苔蘚類）中sweet基因家族的進化關(guān)系進行了簡單分析。
兩個數(shù)據(jù)集中大豆的RNA-seq數(shù)據(jù)分析結(jié)果表明，大部分大豆sweet家族基因在種子和花中轉(zhuǎn)錄上調(diào)，所有sweet基因在到達種子灌漿期前轉(zhuǎn)錄水平一直上調(diào)，之后到達種子成熟前一直下調(diào)，這與之前的在其他物種中研究得到的該基因家族與生殖組織發(fā)育相關(guān)的結(jié)論是一致的。該成果發(fā)表與BMC Genomics雜志。
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b）Matthijs M等人通過分析自測RNA-seq數(shù)據(jù)在三角褐指藻發(fā)現(xiàn)了一類可響應(yīng)氮脅迫的新型轉(zhuǎn)錄因子RGQ1，為了進一步驗證該轉(zhuǎn)錄因子是否在其他硅藻中存在并且也同樣具有響應(yīng)氮脅迫的功能，研究者從公共數(shù)據(jù)庫中下載到了其他兩種硅藻類似研究中的數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)，RGQ1在這兩種硅藻中也存在，且參與了對氮脅迫的響應(yīng)。成果表于Plant Physiology雜志?！?strong>詳細解讀結(jié)果見附件1】
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其他分析思路
整合同一物種公共測序數(shù)據(jù)，構(gòu)建物種完備轉(zhuǎn)錄本序列參考集，用于后續(xù)功能分析。
支撐文獻：
- Iyer MK et al. The landscape of long noncoding RNAs in the human transcriptome. ??Nat Genet. ?2015 ?
文獻概要：整合來源25個項目，18個組織，7256個樣品RNA測序數(shù)據(jù)，使用cufflinks分別重構(gòu)各組織轉(zhuǎn)錄本，之后使用用戶自己開發(fā)的meta-assembly算法找出各組織中高豐度轉(zhuǎn)錄本，最后使用cuffmerge對各樣本組裝得到的轉(zhuǎn)錄本進行合并，最終建立高質(zhì)量的人類轉(zhuǎn)錄本序列參考集，用于后續(xù)功能分析。
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- Wang M et al. ?Long noncoding RNAs and their proposed functions in fibre development of cotton (Gossypium spp.). ?New Phytol. 2015
文獻概要：整合170多個棉屬RNA-seq數(shù)據(jù)集，以海島考基因組為參考，使用tophat+cufflinks流程進行轉(zhuǎn)錄本重構(gòu)（各樣本分開組裝）并預(yù)測其中的lncRNA，之后進行棉纖維發(fā)育相關(guān)lncRNA鑒定。
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mRNA-ncRNA聯(lián)合分析中，利用公共數(shù)據(jù)補充其中一種類型的RNA測序數(shù)據(jù)
支撐文獻：
- Liu X et al. MicroRNA-mRNA regulatory networking fine-tunes the porcine muscle fiber type, muscular mitochondrial respiratory and metabolic enzyme activities. ?BMC Genomics. 2016
文獻概要：聯(lián)合之前項目的高肉品與低肉品豬mRNA測序數(shù)據(jù)與本次項目中的miRNA測序數(shù)據(jù)，并通過pearson相關(guān)系數(shù)建立miRNA與豬肉品質(zhì)各項指標之間的聯(lián)系，最終建立與豬肉品質(zhì)各項指標相關(guān)的mRNA-miRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。
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- Yin H et al. Phylogenetic tree-informed microRNAome analysis uncovers conserved and lineage-specific miRNAs in Camellia during floral organ development.J Exp Bot.2016
文獻概要：研究者取紅杜鵑山茶花的葉、雄蕊、雌蕊心皮、花瓣、花芽5個部位進行了miRNA測序，之前項目中組裝得到的紅杜鵑山茶花的轉(zhuǎn)錄本序列為參考，進行了novel miRNA的預(yù)測。之后通過miRNA表達模式的分析，鑒定到了兩類分別傾向在雄蕊或雌蕊中特異高表達的miRNA，進一步利用miRNA靶基因的功能信息，揭示了這些miRNA在花器官發(fā)育過程中發(fā)揮的生物學功能。
附件2公共數(shù)據(jù)整合分析文獻列表
整合公共數(shù)據(jù)建立物種基因共表達網(wǎng)絡(luò)
[1] Wisecaver JH?et al. A Global Coexpression Network Approach for Connecting Genes to Specialized Metabolic Pathways in Plants. Plant Cell.?2017
[2]Wen Z et al.Expression profiling and functional annotation of noncoding genes across 11 distinct organs in rat development.Sci Rep.?2016
[3] Li?J?et al. Identification and functional analysis of long intergenic noncoding RNA genes in porcine pre-implantation embryonic development.?Sci Rep. 2016
[4] Yu?C et al. Transcriptome dynamics of developing maize leaves and genomewide prediction of cis elements and their cognate transcription factors. Proc Natl Acad Sci?. 2015
[5] Khan FA et al. Analysis of Bos taurus and Sus scrofa X and Y chromosome transcriptome highlights reproductive driver genes. ??Oncotarget.?2017
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利用公共數(shù)據(jù)，研究基因家族轉(zhuǎn)錄水平變化規(guī)律
[6] Patil G. ?et al. Soybean (Glycine max) SWEET gene family: insights through comparative genomics, transcriptome profiling and whole genome re-sequence analysis. BMC Genomics.?2015
[7]Matthijs M?et al.Profiling of the Early Nitrogen Stress Response in the Diatom Phaeodactylum tricornutum Reveals a Novel Family of RING-Domain Transcription Factors. Plant Physiol.?2016
基于公共數(shù)據(jù)建立物種完備轉(zhuǎn)錄組本參考序列
[8]Wang M et al. Long noncoding RNAs and their proposed functions in fibre development of cotton (Gossypium spp.). New Phytol. 2015
[9]Iyer MK et al. The landscape of long noncoding RNAs in the human transcriptome. ??Nat Genet.??2015
[10]Hong Y, et al.?Genome-wide identification and characterization of long intergenic noncoding RNAs and their potential association with larval development in the Pacific oyster. Sci Rep,?2016.
[11] Li J, et al.?Identification and functional analysis of long intergenic noncoding RNA genes in porcine pre-implantation embryonic development.?Sci Rep,2016.
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基于公共數(shù)據(jù)進行ncRNA-mRNA聯(lián)合分析
[12] Xu W et al. Genomic DNA Methylation Analyses Reveal the Distinct Profiles in Castor Bean Seeds with Persistent Endosperms. Plant Physiol.?2016
[13] Liu X et al. MicroRNA-mRNA regulatory networking fine-tunes the porcine muscle fiber type, muscular mitochondrial respiratory and metabolic enzyme activities. BMC Genomics.?2016
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其他分析思路
[14] Sudmant PH, et al.?Meta-analysis of RNA-seq expression data?across species, tissues and studies. Genome Biol, 2015.
[15] Lu L, et al. The goose genome sequence leads to insights?into the evolution of waterfowl and susceptibility?to fatty liver. Genome Biol,?2015.
[16] Shin SC, et al.?Dynamic shifts in occupancy by TAL1?are guided by GATA factors and drive large-scale reprogramming of gene expression during hematopoiesis.?Genome?Res,?2014
[17] Xie D, et al. Rewirable gene regulatory networks in the?preimplantation embryonic development?of three species.?Genome Res,?2010